Laporan Mikrobiologi

PEWARNAAN MIKROBA

(Pewarnaan Gram dan Pewarnaan Spora)

Pendahuluan

   Mikroorganisme yang berada di alam mempunyai morfologi, struktur, maupun sifat-sifat yang khas, salah satunya bakteri. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan, dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel-sel individu bakteri dapat berbentuk seperti bola / elips, batang (silindris), maupun spiral atau heliks (Pelczar dan Chan 2007). Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena bakteri tidak berwarna dan juga sangat kecil. Hal tersebut dapat diatasi dengan teknik pewarnaan mikroba sehingga sel bakteri dapat diamati dengan mudah dan jelas.

   Pengamatan morfologi sel meliputi uji pewarnaan Gram, pewarnaan spora, bentuk sel dan uji pergerakan bakteri atau motilitas (Hadioetomo 1993). Percobaan kali ini menggunakan uji pewarnaan Gram dan pewarnaan spora. Pewarnaan Gram ialah perbedaan reaksi pewarnaan berdasarkan komposisi dinding sel bakteri (Hadioetomo 1993). Pewarnaan spora ialah pewarnaan yang bertujuan untuk menguji keberadaan spora pada bakteri yang berbeda berdasarkan kekuatan spora mengikat senyawa pewarna. Endospora adalah organisme yan dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Pelczar dan Chan 2007).

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan ialah pembakar spirtus, bak pewarna, kertas serap, preparat, korek api, lap atau tissue, jarum ose, penangas air, dan  mikroskop.

Bahan yang digunakan ialah alkohol 70%, akuades, suspensi bakteri ecolli dan bacillus, kristal violet (Gram A), kalium iodida (Gram B), alkohol (Gram C), safranin (Gram D), dan malacite green.

Prosedur

Pewarnaan Gram. Tahap pertama, meja percobaan, tangan, dan preparat dibersihkan dengan alkohol. Tahap dua, preparat dikibaskan di pembakar spirtus sekilas saja, kemudian ose dipanaskan atau di sterilisasi dan preparat diolesi suspensi bakteri bacillus dan ecolli. Tahap tiga, olesan bakteri diteteskan larutan Gram A sebanyak 2-3 tetes dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian setelah 1 menit dicuci dengan akuades dan dikeringkan dengan kertas isap. Tahap empat, olesan bakteri diteteskan larutan Gram B sebanyak 2-3 tetes dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan akuades dan dikeringkan. Tahap lima, olesan bakteri diteteskan larutan Gram C dan dibiarkan selama 30 detik, kemudian dicuci dengan akuades dan dikeringkan. Tahap enam, olesan bakteri diteteskan larutan Gram D dan dibiarkan selama 30 detik, kemudian dicuci dengan akuades dan dikeringkan dengan kertas isap. Tahap akhir, olesan bakteri diamati di bawah mikroskop.

Pewarnaan Spora. Tahap pertama, meja percobaan, tangan, dan preparat dibersihkan dengan alkohol. Tahap dua, disiapkan dua preparat untuk bakteri bacillus (preparat 1) dan ecolli (preparat 2), kemudian preparat satu dioleskan bakteri bacillus dan preparat dua dioleskan bakteri ecolli. Tahap tiga, olesan bakteri digenangi dengan malacite green diatas penangas air selama 2-3 menit, kemudian didinginkan dan dialiri dengan akuades. Tahap empat, olesan bakteri digenangi dengan safranin selama 30 detik, setelah itu dibilas dengan akuades dan dikeringkan dengan kertas isap. Tahap akhir, olesan bakteri diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali yang sebelumnya preparat berisi olesan bakteri diteteskan minyak inersi.

Hasil Pengamatan

Tabel 1 Hasil Pewarnaan Gram

Jenis Bakteri	Pewarnaan Gram	Warna dan Bentuk Bakteri
Bacillus		Berwarna ungu dan berbentuk tidak beraturan.
Ecolli		Berwarna merah dan berbentuk kokus.

Tabel 2 Hasil Pewarnaan Spora

Jenis Bakteri	Pewarnaan Spora	Warna Bakteri dan berspora
Bacillus		Warna hijau (bukan spora atau tidak berspora)
Ecolli		Berwarna merah (tidak berspora)

Pembahasan

Percobaan kali ini dengan metode pewarnaan Gram dan pewarnaan spora masing-masing memiliki kelebihan. Kelebihan dari metode pewarnaan Gram ialah dapat digunakan untuk mengetahui mofologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Selain itu dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Kekurangannya ialah memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak dan suspensi bakteri atau sampel harus dalam bentuk cairan. Pewarnaan Gram menggunakan empat jenis reagen. Reagen pertama (kristal violet dan KI) disebut warna dasar atau warna primer yang akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua (alkohol) disebut bahan pencuci warna. Warna dasar tercuci atau tidaknya tergantung pada komposisi dinding sel masing-masing bakteri, bila dinding sel kuat mengikat warna dasar maka warna dasar tidak akan hilang, sebaliknya jika dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar maka saat pencucian warna dasar akan hilang. Reagen terakhir (safranin) disebut pembanding, bila warna dasar tidak hilang maka yang tampak terlihat ialah warna dasar sedangkan bila warna dasar hilang maka yang terlihat ialah warna dari safranin tersebut. Kelebihan dari metode pewarnaan spora ialah dapat mengetahui bakteri yang memiliki spora yang ditandai dengan dihasilkannya warna hijau pada endospora (Hadioetomo 1993).

Hasil dari pewarnaan Gram ialah menghasilkan bakteri bacillus berwarna ungu (gram positif) dan bakteri ecolli berwarna merah (gram negatif). Hal ini karena dinding sel bakteri gram negatif terdiri dari 5-20% peptidoglikan dan selebihnya adalah polisakarida, sedangkan dinding sel bakteri gram positif mengandung 90% peptidoglikan dan selebihnya adalah asam teikoat. Sel bakteri gram positif terlihat berwarna ungu karena dapat membentuk ikatan komplek denga pewarna pertama yaitu komplek kristal violet. Sel bakteri gram negatif pada pemberian larutan alkohol 95% dapat meningkatkan porositas dinding sel dengan melarutkan lipid pada membran luar sehingga komplek kristal violet akan terlepas dan sel menjadi tidak berwarna. Selanjutnya sel akan berwarna merah karena terwarnai oleh warna pembanding yaitu safranin (Hadioetomo 1993).

Selain itu, setelah diamati di bawah mikroskop terlihat bahwa bakteri ecolli berbentuk kokus. Seharusnya bakteri bacillus berbentuk basil, akan tetapi bentuk dari bakteri bacillus tidak dapat diamati karena tidak dapat ditemukan oleh mikroskop. Hal ini mungkin karena warna dasar yang didapat dari pewarnaan Gram kurang jelas sehingga saat diamati di bawah mikroskop tidak terlihat bentuknya hanya terlihat warna dari bakteri bacillus.

Spora bakteri adalah bentuk bakteri dalam mempertahankan diri dari pengaruh lingkungan luar (Fardiaz 1992). Hasil dari pewarnaan spora ialah menghasilkan bakteri ecolli tidak berwarna hijau akan tetapi berwarna merah (tidak berspora). Hal ini karena bakteri yang tidak memiliki spora cenderung tidak tahan terhadap pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. Saat diwarnai dengan malacite, sel vegetatif akan mampu berikatan dengan pewarna tersebut tetapi dapat dilunturkan setelah dilakukan pencucian karena tidak berikatan kuat dengan pewarna malacite gree. Setelah dilakukan pangecatan dengan safranin, sel vegetatif akan berikatan dengan pewarna safranin sehingga warna yang dihasilkan ketika diamati menunjukkan warna merah (Pratita dan Putra 2012)

Sedangkan hasil dari pewarnaan spora seharusnya menghasilkan bakteri bacillus berwarna hijau (berspora). Saat pengamatan ditemukan warna hijau oleh mikroskop, akan tetapi itu bukan spora melainkan warna dari malacite green yang melekat pada preparat yang masih belum tercuci karena pecucian yang kurang bersih. Seharusnya bakteri bacillus berwarna hijau karena bakteri yang menghasilkan spora akan mengikat kuat senyawa pewarna (malacite green) dan ketika dilakukan pewarnaan selanjutnya menggunakan safranin, sel spora tidak dapat berikatan dengan pewarna lain karena sudah berikatan dengan malacite green (Pratita dan Putra 2012). Hal ini karena spora memiliki selubung yang keras dan tebal (Sunatmo 2007).

Selain itu, kemungkinan disebabkan karena sel bakteri sudah tua maka sel vegetatif akan pecah sehingga endospora akan terlepas menjadi spora bebas. Spora akan lebih tahan lama dalam keadaan yang ekstrim, misalnya dalam keadaan kering, panas atau adanya bahan kimia yang beracun (Agustina, Yulvizar, dan Nursanty 2013).

Simpulan

Berdasarkan hasil percobaan pewarnaan Gram dihasilkan bakteri ecolli termasuk bakteri gram negatif karena menghasilkan warna merah dan berbentuk kokus, sedangkan bakteri bacillus tidak dapat diamati. Seharusnya bacillus termasuk bakteri gram positif yang akan menghasilkan warna merah dan berbentuk basil. Hasil percobaan pewarnaan spora dihasilkan bakteri ecolli berwarna merah, ini berarti ecolli tidak memiliki spora. Sedangkan pada bacillus dihasilkan warna hijau namun warna tersebut bukan spora melainkan warna malacite green, seharusnya bacillus memiliki spora.

Daftar Pustaka

Agustina D, Yulvizar C, dan Nursanty R. 2013. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri pada Ikan Kembung (Rastrelliger sp.) Asin Berkitosan. Jurnal Biospecies 6(1):15-19. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Syiah Kuala. Banda Aceh.

Fardiaz S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama.

Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek: Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.

Pelczar M.J. dan E.C.S. Chan. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.

Pratita MYE dan Putra SR. 2012. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Termofilik dari Sumber Mata Air Panas di Songgoriti Setelah Dua Hari Inkubasi. Jurnal Teknik Pomits 1(1):1-5. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS). Surabaya.

Sunatmo TI. 2007. Eksperimen Mikrobiologi dalam Laboratorium. Bogor: Ardy Agency.