Laporan Biokimia

UJI KETENGIKAN, SALKOWSKI, DAN LIEBERMAN BUCHARD UNTUK KOLESTEROL

Pendahuluan

Kolesterol adalah salah satu lemak tubuh yang berada dalam bentuk bebas dan ester dengan asam lemak. Lemak yang dimakan terdiri atas kolesterol lemak jenuh dan lemak tidak jenuh. Karbohidrat dan lemak tersebut di dalam tubuh akan diproses menjadi suatu  senyawa yang disebut asetil koenzim A. Bahan ini akan membentuk beberapa zat penting seperti asam lemak, trigliserida, fosfolipid dan kolesterol, sehingga bila tubuh terlalu banyak asupan makanan yakni melebihi kebutuhan maka jumlah trigliserida dan kolesterol akan meningkat. Hal tersebut akan membuat endapan / kristal lempengan yang akan mempersempit / menyumbat pembuluh darah (Dalimartha 2001). Oleh sebab itulah diperlukan pengujian kolesterol pada lipid untuk mengetahui keberadaan kolesterol, sehingga dapat mencegah meningkatnya kolesterol dalam tubuh yang terdapat di dalam makanan yang dikonsumsi.

Fungsi dari kolesterol ialah sebagai pelindung otak, 11 % dari berat otak ialah kolesterol; bersama zat gizi lainnya kolesterol dan sinar matahari membentuk vitamin D; merupakan zat esensial untuk membran sel; merupakan bahan pokok untuk pembuatan garam empedu yang diperlukan untuk pencernaan makanan; bahan baku pembentukan hormon steroid, misalnya progesterone dan estrogen pada wanita, testosteron pada laki-laki (Kasim dkk 2006). Struktur kolesterol sebagai berikut:

Gambar 1 Struktur Kolesterol (Dalimartha 2001)

Selain uji kolesterol, dilakukan juga uji ketengikan pada lipid. Ketengikan disebabkan oleh adanya serangan  oksigen pada lemak tidak jenuh yang menyebabkan terjadinya oksidasi lemak yang mengahsilkan bau tengik.  Proses ketengikan ini dapat dihambat dengan memberi antioksidan (Dotulong 2009). Pengujian ketengikan pada lipid ialah untuk mengetahui ketengikan suatu bahan yang akan dikonsumsi atau bahan makanan, sehingga dapat membedakan makanan yang layak dimakan atau tidak.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah erlenmeyer tertutup, tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet tetes, pipet mohr, gelas piala, bulb hitam dan merah, bunsen, kaki tiga, kasa, penjepit, dan sudip.

Bahan yang digunakan adalah HCl, minyak kelapa, minyak kelapa tengik, lemak hewan, mentega, margarin, floroglusinol, kertas saring, CaCO₃, larutan kolesterol dalam kloroform, asam sulfat pekat, dan asam asetat pekat.

Metode

Uji Ketengikan. Bahan uji (minyak kelapa, minyak kelapa tengik, lemak hewan, mentega, margarin) sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan HCl pekat sebanyak 5 ml. Selanjutnya, disediakan kertas saring, kemudian dicelupkan dalam floroglusinol. Setelah itu, ke dalam erlenmeyer dimasukkan serbuk CaCO₃, kemudian erlenmeyer ditutup dan kertas saring dibiarkan tergantung dalam erlenmeyer. Proses reaksi dibiarkan selama 10-20 menit, kemudian diamati perubahan warna pada kertas saring. Bila berwarna merah, berarti bahan uji tengik.

Uji Salkowski Untuk Kolesterol. Larutan kolesterol dalam kloroform sebanyak 3 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan asam sulfat pekat sebanyak 3 ml. Selanjutnya, larutan dikocok dan dibiarkan sampai lapisan terpisah. Setelah itu, diamati warna yang terjadi. Bila berwarna merah, berarti bahan uji mengandung kolesterol.

Uji Lieberman Buchard Untuk Kolesterol. Larutan kolesterol dalam kloroform sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 3 tetes asam asetat pekat. Selanjutnya, ditambahkan asam sulfat pekat tetes demi tetes sampai larutan berwarna hijau (dihitung berapa tetes). Setelah itu, dikocok dan dibiarkan beberapa menit.

Hasil Pengamatan

Hasil pengujian uji kualitatif minyak atau lipid pada berbagai macam bahan uji dan pelarut sebagai berikut:

Tabel 1 Hasil Uji Ketengikan

Bahan Uji	Warna Kertas	Hasil Pengamatan (+/-)
Minyak Kelapa	Merah Muda (+)	+
Minyak Kelapa Tengik	Merah Muda (++)	+
Lemak Hewan	Merah Muda (++)	+
Mentega	Merah Muda (+)	+
Margarin	Merah Muda (+++)	+

Keterangan : (+) warna kertas saring merah muda / tengik (-) warna kertas saring     putih / tidak tengik

Gambar 2 Hasil Uji Ketengikan pada Bahan Uji (a) minyak kelapa (b) minyak kelapa tengik (c) lemak hewan (d) mentega (e) margarin

Tabel 2 Hasil Uji Kolesterol

Nama Uji	Hasil Pengamatan (+/-)	Perubahan Warna Larutan
Uji Salkowski	+	Bagian asam berwarna kuning dengan flouresensi berwarna hijau, bagian kloroform berwarna merah.
Uji Lieberman Buchard	+ (50 tetes)	Tak berwarna - hijau

Keterangan : Uji Salkowski (+) warna merah / ada kolesterol (-) tidak terbentuk warna merah

                        Uji Lieberman Buchard (+) warna hijau / ada kolesterol (-) tidak terbentuk warna hijau

Gambar 3 Hasil Uji Kolesterol pada uji (a) Lieberman Buchard (b) Salkowski

Pembahasan

Uji Ketengikan. Prinsip uji ketengikan ialah warna merah  muda menunjukkan bahwa bahan tersebut tengik. Warna merah muda dihasilkan dari reaksi antara floroglusinol dengan molekul oksigen yang mengoksidasi lemak/minyak tersebut (Winarno 1973). Hasil percobaan menunjukkan semua bahan uji tengik, ditandai dengan timbulnya warna merah muda pada kertas saring. Hasil percobaan sesuai dengan yang seharusnya, hal ini karena semua bahan uji termasuk asam lemak dilihat dari komposisinya. Minyak kelapa mengandung 84% trigliserida dengan tiga molekul asam lemak jenuh, 12% trigliserida dengan dua asam lemak jenuh dan 4% trigliserida dengan asam lemak jenuh (Ketaren 1986). Margarin tersusun dari asam lemak nabati (tak jenuh) yaitu asam linoleat dan linolenat. Mentega tersusun dari asam lemak hewani (jenuh) yaitu asam stearat, asam palmitat, dan asam oleat. Lemak hewan termasuk dalam asam lemak tak jenuh karena memiliki struktur asam oleat yang mempunyai ikatan rangkap dua (Wildan 1997). Ketengikan pada kebanyakan lemak atau minyak menunjukkan bahwa kebanyakan golongan trigliserida tersebut telah teroksidasi oleh oksigen dalam udara bebas. Hasil percobaan menunjukkan margarin yang paling tengik, hal ini karena margarin termasuk asam lemak tak jenuh. Asam lemak tak jenuh lebih mudah bereaksi dengan molekul oksigen dalam udara, sehingga memutuskan ikatan gandanya menjadi ikatan tunggal. Hal ini menyebabkan minyak mengalami ketengikan. Fungsi floroglusinol sebagai penampak bercak. HCl berfungsi menyumbangkan ion-ion hidrogennya yang dapat memecah unsur lemak sehingga terbentuk lemak radikal bebas dan hidrogen radikal bebas. Kedua bentuk radikal ini bersifat sangat reaktif dan pada tahap akhir oksidasi akan dihasilkan peroksida. Faktor yang mempengaruhi ketengikan ialah ketengikan oleh oksidasi, ketengikan oleh enzim, dan ketengikan oleh proses hidrolisa. Ketengikan oleh oksidasi, disebabkan oleh otooksidasi radikal asam lemak tidak jenuh dalam lemak. Otooksidasi dimulai dengan pembentukan radikal-radikal bebas yang disebabkan oleh faktor-faktor yang dapat mempercepat reaksi seperti cahaya, panas, peroksida lemak atau hidroperoksida, logam-logam berat seperti Cu, Fe, Co, dan Mn, logam porfirin seperti hematin,  hemoglobin, mioglobin, klorofil, dan enzim-enzim lipoksidase. Ketengikan oleh enzim, enzim peroksida dapat mengoksidasi asam lemak tidak jenuh sehingga terbentuk peroksida, disamping itu enzim peroksida dapat mengoksidasi asam lemak jenuh pada ikatan karbon atom β, sehingga membentuk asam keton dan akhirnya metil keton. Ketengikan oleh proses hidrolisa, minyak atau lemak akan diubah menjadi bermacam-macam asam lemak bebas dan gliserol. Reaksi hidrolisa yang dapat mengakibatkan kerusakan minyak atau lemak ini terjadi karena adanya kandungan air dalam minyak atau lemak, yang pada akhirnya menyebabkan ketengikan dengan perubahan rasa dan bau pada minyak tersebut (Ketaren 1986). Berikut reaksi uji ketengikan:

Gambar 4 Reaksi Uji Ketengikan (Winarno 1992)

Uji Kolesterol. Prinsip uji Salkowski ialah apabila sterol dengan konfigurasi tidak jenuh di dalam molekulnya direaksikan dengan asam kuat dalam kondisi bebas air, maka akan memberikan warna karakteristik (Poedjiadi 1994). Prinsip uji Lieberman Buchard ialah kolesterol dengan asam asetat anhidrida dan asam sulfat pekat membentuk warna hijau kecoklatan. Absorben warna ini sebanding dengan kolestrol dalam sampel (Poedjiadi 1994). Hasil percobaan uji Salkowski menunjukkan bahan uji terdapat kolesterol, ditandai dengan terbentuknya warna merah. Hasil percobaan uji Lieberman Buchard menunjukkan bahan uji terdapat kolesterol, ditandai dengan terbentuknya warna hijau yang sesuai dengan prinsip ujinya. Perekasi Lieberman Buchard merupakan campuran antara asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat. Alasan digunakannya asam asetat anhidrat adalah untuk membentuk turunan asetil dari steroid yang akan membentuk turunan asetil di dalam kloroform. Fungsi dari penambahan asam sulfat pekat pada uji Salkowski dan Lieberman Buchard ialah membentuk kompleks warna. Fungsi kloroform anhidrat pada uji Salkowski ialah melarutkan kolesterol (Lehninger 1988). Apabila pada pengujian Lieberman Buchard asam asetat anhidrat diganti dengan asam asetat pekat maka akan didapatkan hasil yang sama atau penggantian asam asetat anhidrat dengan asam asetat pekat tidak berpengaruh terhadap hasil. Mekanismenya ialah ketika asam sulfat ditambahkan ke dalam campuran yang berisi kolesterol, maka molekul air berpindah dari gugus C3 kolesterol, kolesterol kemudian teroksidasi membentuk 3,5-kolestadiena. Produk ini dikonversi menjadi polimer yang mengandung kromofor yang menghasilkan warna hijau. Warna hijau ini menandakan hasil yang positif. Reaksi positif uji ini ditandai dengan adanya perubahan warna dari terbentuknya warna pink kemudian menjadi biru-ungu dan akhirnya menjadi hijau tua (Poedjiadi 1994). Uji kolesterol selain kedua uji di atas ialah cara ekstraksi menggunakan pelarut organik (untuk mengidentifikasi keberadaan kolesterol pada suatu bahan makanan); dengan alat fotometri yaitu suatu alat yang digunakan untuk mengukur kadar kolesterol secara kuantitatif (Notoatmodjo 2005); metode enzimatis kolorimetri (GPO-PAP), sebelum dilakukan pemeriksaan biasanya penderita disuruh berpuasa 10 sampai 12 jam sebelumnya, dengan metode ini trigliserida akan dihidrolisa secara enzimatis menjadi gliserol dan asam bebas, dengan lipase khusus akan membentuk kompleks warna yang dapat diukur kadarnya menggunakan spektrofotometer; serta kolesterol dapat dideteksi dan ditentukan kuantitasnya dengan menggunakan metode HPLC-UV, metode KCKT, dan Gas Chromatografi (Wirawan 2002). Kolesterol mengalami reaksi adisi pada ikatan rangkapnya. Adisi dengan hidrogen membentuk dihidrokolesterol, dan dengan halogen membentuk kolesterol dihalida. Adapun reaksi adisi tersebut sebagai berikut : 

Gambar 5 Reaksi Adisi Kolesterol (Poedjiadi 1994)

Reaksi pembentukan warna hijau antara kolesterol dengan reagen Lieberman Buchard ialah :

Gambar 6 Reaksi Uji Lieberman Buchard (Lawrie 1995)

Simpulan

Hasil percobaan uji ketengikan menunjukkan semua bahan uji tengik, ditandai dengan timbulnya warna merah muda pada kertas saring. Hal ini membuktikan bahwa asam lemak dapat teroksidasi oleh oksigen dalam udara bebas sehingga tengik. Terutama untuk asam lemak tak jenuh yang sangat mudah teroksidasi. Hasil percobaan uji Salkowski dan Lieberman Buchard menunjukkan bahan uji terdapat kolesterol, ditandai dengan terbentuknya warna merah (uji Salkowski) dan warna hijau (uji Lieberman Buchard) yang sesuai dengan prinsip ujinya.

Daftar Pustaka

Dalimartha S. 2001.  36 Resep Tumbuhan Untuk Menurunkan Kolesterol. Jakarta: Penebar Swadaya.

Dotulong V. 2009. Studi Oksidasi Lipid Ikan Tembang (Sardinella fuinbriata) Pindang yang Diberi Larutan Kunyit (Curcuma domestica Val). Jurnal WIPTEK 1(34):1-4 ISSN 0854-0667. FPIK UNSRAT. Manado.

Kasim E, Y. Kurniawati, dan N. Nurhidayat. 2006. Pemanfaatan Isolat Lokal Monascus purpureus untuk Menurunkan Kolesterol Darah pada Tikus Putih Galur Sprague Dawley. Jurnal Biodiversitas 7(2):123-126 ISSN 1412-033X. Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI). Bogor.

Ketaren. 1986. Pengantar Teknologi Minyak dan Lemak Pangan. Jakarta:Universitas Indonesia press.

Lawrie RA. 1995. Ilmu Daging. Jakarta : UI Press.

Lehninger A. 1988. Dasar-dasar Biokimia. Maggy Thenawidjaya, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.

Notoatmojo S. 2005. Metodologi Penelitian Kesehatan. Jakarta: PT. Rineka Cipta.

Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia.

Wildan F. 1997. Perbandingan Komposisi Asam Lemak Rantai Panjang dari Lemak Hewani dan Lemak Nabati. Jurnal Lokakarya Fungsional  20(3):157-164. Balai Penelitian Ternak Ciawi. Bogor.

Winarno F.G. 1973. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama.

Winarno F.G. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama.

Wirawan R. 2002. Pemeriksaan Laboratorium Hematologi Sederhana. Jakarta: Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia