Laporan Biokimia

PENGENDAPAN OLEH LOGAM, GARAM, ALKOHOL, UJI KOAGULASI, DAN DENATURASI PROTEIN

Pendahuluan

Protein merupakan makromolekul yang paling melimpah di dalam sel. Unit pembangunnya adalah asam amino yang berikatan secara kovalen untuk menghubungkan molekul-molekul menjadi rantai (Winarno 1997). Struktur sebuah protein terbagi atas tiga yaitu struktur primer, sekunder, tersier, dan kuartener. Struktur primer adalah struktur dasar dari protein. Susunan linier asam amino dalam protein yang merupakan suatu rangkaian unik dari asam amino yang menentukan sifat dasar dari berbagai protein, dan secara umum menentukan bentuk struktur sekunder dan tersier. Struktur sekunder adalah rantai polipeptida yang berlipat-lipat dan merupakan bentuk tiga dimensi dengan cabang-cabang rantai polipeptidanya tersusun saling berdekatan. Protein terbentuk oleh adanya ikatan hidrogen antar asam amino dalam rantai sehingga strukturnya tidak lurus, melainkan bentuk  zig zag  dengan gugus R mencuat keatas dan kebawah. Contoh struktur ini adalah bentuk α-heliks pada wol, serta bentuk heliks pada kolagen (Martoharsono 1998).

Struktur tersier adalah susunan dari struktur sekunder yang satu dengan struktur sekunder yang lain. Biasanya bentuk-bentuk sekunder ini dihubungkan oleh ikatan hidrogen, ikatan garam, ikatan hidrofobik, dan ikatan disulfida. Ikatan disulfida merupakan ikatan yang terkuat dalam mempertahankan struktur tersier protein. Struktur primer, sekunder, dan tersier umumnya hanya melibatkan satu rantai polipeptida, tetapi bila struktur ini melibatkan beberapa polipeptida dalam membentuk suatu protein, maka disebut dengan struktur kuartener (Martoharsono 1998).

Salah satu yang termasuk dalam protein ialah albumin. Albumin ialah protein yang dapat larut air serta dapat terkoagulasi oleh panas dimana terdapat dalam serum darah dan bagian putih telur (Poedjiaji 1994). Salah satu komposisi dari albumin ialah fosfor (P) dan belerang (S). Protein dapat mengalami peristiwa yang dinamakan titik isoelektrik. Titik isoelektrik prinsipnya berdasarkan pada perbedaan dalam sifat ionik dari permukaan asam amino, pada pH yang lebih rendah muatan netto akan lebih positif dan pH yang lebih tinggi muatan netto akan lebih negatif.  Keadaan saat pH asam amino yang bermuatan positif  sama dengan muatan negatif  (muatan nettonya nol)  disebut  titik  isoelektrik protein (Yandri 2011).

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet tetes, pipet mohr, gelas piala, kertas saring, corong, arloji, bulb hitam dan merah, bunsen, kaki tiga, kasa, penjepit, dan batang pengaduk.

Bahan yang digunakan adalah larutan albumin, HgCl₂ 2%, Pb-asetat 5%, AgNO₃ 5%, kristal (NH₄)SO₄, larutan protein, asam asetat 1M, pereaksi millon, pereaksi biuret, HCl 0.1 M, etanol 95%, NaOH 0.1 M, buffer asetat pH 4.7, dan akuades.

Metode

Pengendapan oleh Logam. Larutan albumin sebanyak 3 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 5 tetes larutan HgCl₂ 2%. Percobaan diulangi dengan larutan Pb-asetat 5% dan AgNO₃ 5%. Setelah itu, diamati larutan yang paling cepat dan banyak menghasilkan endapan.

Pengendapan oleh Garam. Larutan protein sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan sedikit demi sedikit (NH₄)SO₄ dan diaduk hingga jenuh. Setelah itu, larutan disaring, kemudian diuji kelarutan endapan dalam air 3 ml dan pereaksi millon 3 tetes serta filtrat diuji dengan pereaksi biuret.

Uji Koagulasi. Larutan protein sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 2 tetes asam asetat 1M. Selanjutnya, larutan dipanaskan dalam penangas air selama 5 menit. Setelah itu, endapan yang terbentuk diambil dengan batang pengaduk atau disaring terlebih dahulu. Tahap akhir, endapan diuji kelarutannya dalam air 3 ml dan pereaksi millon 3 tetes.

Pengendapan oleh Alkohol. Pertama, disiapkan empat tabung reaksi yang bersih dan kering. Tabung satu dimasukkan larutan albumin sebanyak 2.5 ml, kemudian ditambahkan HCl 0.1 M sebanyak 0.5 ml dan etanol 95% sebanyak 3 ml. Tabung dua dimasukkan larutan albumin sebanyak 2.5 ml, kemudian ditambahkan NaOH 0.1 M sebanyak 0.5 ml dan etanol 95% sebanyak 3 ml. Tabung tiga dimasukkan larutan albumin sebanyak 2.5 ml, kemudian ditambahkan buffer asetat pH 4.7 sebanyak 0.5 ml dan etanol 95% sebanyak 3 ml. Tabung empat dimasukkan larutan albumin sebanyak 2.5 ml, kemudian ditambahkan etanol 95% sebanyak 3.5 ml. Setelah itu, diamati tabung manakah protein yang tidak larut.

Denaturasi Protein. Pertama, disiapkan tiga tabung reaksi yang bersih dan kering. Tabung satu dimasukkan larutan albumin sebanyak 4.5 ml, kemudian ditambahkan HCl 0.1 M sebanyak 0.5 ml. Tabung dua dimasukkan larutan albumin sebanyak 4.5 ml, kemudian ditambahkan NaOH 0.1 M sebanyak 0.5 ml. Tabung tiga dimasukkan larutan albumin sebanyak 4.5 ml, kemudian ditambahkan buffer asetat pH 4.7 sebanyak 0.5 ml. Setelah itu, ketiga larutan tersebut dipanaskan dalam penangas air selama 15 menit, kemudian didinginkan. Tabung satu dan dua ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4.7, kemudian diamati dan dicatat perubahan yang terjadi.

Hasil Pengamatan

Hasil pengujian ada atau tidaknya endapan protein dengan uji pengendapan oleh logam sebagai berikut:

Tabel 1 Hasil Uji Pengendapan Protein oleh Logam Berat

Logam Berat	Hasil Pengamatan (+/-)	Perubahan Warna Larutan
HgCl2 2%	(+)	Putih keruh
Pb-asetat 5%	(+)	Putih keruh
AgNO3 5%	(+)	Putih keruh

Keterangan: (+) Ada endapan, (-) Tidak ada endapan

Kecepatan mengendap: HgCl₂  > AgNO₃ > Pb-asetat

Gambar 1 Hasil Pengendapan Protein oleh Logam Berat pada (a) AgNO₃ 5% (b)

                   HgCl₂ 2% (c) Pb-asetat 5%

Hasil pengujian ada atau tidaknya protein dengan uji pengendapan oleh garam sebagai berikut:

Tabel 2 Hasil Uji Pengendapan Albumin oleh (NH₄)SO₄

Uji	Hasil Pengamatan (+/-)	Perubahan Warna Larutan
Uji kelarutan	(-)	Tidak larut, tetap bening atau tidak berwarna
Uji Millon	(-)	Tidak larut, ada endapan, tidak berwarna
Uji Biuret	(-)	Larut, tidak berwarna-biru muda

Keterangan: (+) Ada protein, (-) Tidak ada protein

Gambar 2 Hasil Pengendapan Albumin oleh (NH₄)SO₄ dengan (a) uji

                            kelarutan (b) uji millon (c) uji biuret

Hasil pengujian pengaruh pemanasan pada albumin dengan uji koagulasi sebagai berikut:

Tabel 3 Hasil Uji Pengaruh Pemanasan Terhadap Albumin

Uji	Hasil Pengamatan (+/-)	Perubahan Warna Larutan
Uji kelarutan	(-)	Tidak larut
Uji Millon	(+)	Larut, berwarna kuning
Uji Biuret	(+)	Larut, berwarna ungu

Keterangan: (+) Ada protein, (-) Tidak ada protein

Gambar 3 Hasil Pengaruh Pemanasan Terhadap Albumin dengan (a) uji millon (b)

                  uji biuret

Hasil pengujian pengendapan albumin dengan uji pengendapan oleh alkohol sebagai berikut:

Tabel 4 Hasil Uji Pengendapan Albumin oleh Alkohol

Larutan	Hasil Pengamatan (+/-)	Perubahan Warna Larutan
Albumin + HCl + etanol	(+)	Agak keruh
Albumin + NaOH + etanol	(-)	Tidak berwarna
Albumin + buffer asetat pH 4.7 + etanol	(+++)	Sangat keruh
Albumin + etanol	(++)	Keruh

Keterangan: (+/-) tingkat kejernihan antar molekul

        

Gambar 4 Hasil Pengendapan Albumin oleh Alkohol dengan Campuran (a)

Albumin + HCl + etanol (b) Albumin + NaOH + etanol (c) Albumin + buffer asetat pH 4.7 + etanol (d) Albumin + etanol

Hasil pengujian denaturasi protein sebagai berikut:

Tabel 5 Hasil Uji Denaturasi Protein

Larutan	Hasil Pengamatan
	Hasil Pengamatan (+/-)	Sebelum Pemanasan	Setelah Pemanasan	Setelah Ditambah Buffer Asetat pH 4.7
Albumin + HCl	(+)	Putih keruh	Putih keruh	Putih keruh
Albumin + NaOH	(-)	Putih keruh	Putih bening	Putih bening
Albumin + buffer asetat pH 4.7	(+)	Putih keruh	Putih susu	Putih susu

Keterangan: (+) Ada endapan, (-) Tidak ada endapan (-)

Gambar 5 Hasil Denaturasi Protein pada Larutan (a) albumin + HCl (b) albumin +

      NaOH (c) Albumin + buffer asetat pH 4.7

Pembahasan

            Pengendapan oleh Logam. Prinsip uji pengendapan protein dengan logam adalah pembentukan endapan akibat penambahan logam berat Ag, Pb, dan Hg akan membentuk endapan logam proteinat. Dapat dikatakan pengendapan ini terjadi apabila protein yang berada dalam keadaan isoelektrik bermuatan negatif bertemu dengan logam yang bermuatan positif sehingga menyebabkan netralisasi dan menghasilkan endapan garam proteinat yang mengendap dan bersifat reversible (Yandri 2011). Hasil percobaan, saat albumin ditambahkan dengan HgCl₂, Pb-asetat, dan AgNO₃ larutan berwarna putih keruh. Hal ini disebabkan karena adanya kemampuan protein atau asam amino untuk berikatan dengan ion logam. Berdasarkan hasil perobaan dihasilkan larutan Pb-asetat memiliki endapan yang paling banyak daripada HgCl₂ dan AgNO₃.  Seharusnya endapan urutan endapan yang paling banyak ialah AgNO₃ > HgCl₂ > Pb-asetat. Hal ini dapat terjadi karena dipengaruhi oleh kereaktifan dari logam Ag, Hg, dan Pb yang sesuai dengan posisi unsur tersebut di tabel SPU. Ag dapat membentuk endapan banyak sebab Ag paling reaktif diantara dua unsur tersebut (logam Ag mempunyai electron valensi yang lebih banyak). Berikut reaksi pengendapan protein oleh logam berat HgCl₂:

Gambar 6 Reaksi Pengendapan Protein oleh Logam Berat HgCl₂

            Pengendapan oleh Garam. Prinsip uji pengendapan protein oleh garam ialah protein akan mengalami pengendapan bila ditambahi garam. Pengendapan tersebut terjadi karena daya larut protein yang berkurang sehingga terbentuk endapan (Winarno 1997). Berdasarkan hasil percobaan, dihasilkan larutan protein mengendap atau tidak larut pada uji millon, sedangkan uji biuret dihasilkan larutan protein larut dan larutan berwarna biru muda.  Hal ini terjadi karena pada penambahan garam dengan konsentrasi tertentu kelarutan protein menurun (salting out). Molekul air yang berikatan dengan ion garam semakin banyak sehingga menyebabkan penarikan selubung air yang mengelilingi permukaan protein. Peristiwa ini mengakibatkan protein saling berinteraksi, beragregrasi, kemudian mengendap. Sedangkan salting in ialah kelarutan protein pada pH dan suhu tertentu meningkat dengan kenaikan konsentrasi garam (Suwarti 2003). Berikut reaksi pengendapan protein oleh garam:

Gambar 7 Reaksi Pengendapan Protein oleh Garam

Uji Koagulasi. Prinsip uji koagulasi adalah protein akan mengalami koagulasi apabila dipanaskan pada suhu 50^oC atau lebih. Koagulasi ini hanya terjadi bila larutan protein berada titik isolistriknya (Poedjiadi, 1994). Fungsi penambahan asam asetat dan dilakukan pemanasan ialah agar terbentuk gumpalan-gumpalan putih yang menunjukkan protein telah terkoagulasi. Selain itu pemanasan juga dapat merusak struktur protein sehingga protein mengalami denaturasi, akibatnya terbentuk endapan (tidak larut) pada larutan. Berdasarkan hasil percobaan, dihasilkan endapan albumin yang terjadi setelah penambahan asam asetat, saat direaksikan dengan pereaksi millon memberikan hasil positif. Hal ini menunjukkan bahwa endapan tersebut masih bersifat sebagai protein, namun sudah mengalami perubahan struktur atau mengalami denaturasi sehingga pada uji kelarutan, larutan tidak larut. Endapan juga terbentuk karena larutan mengendap pada titik isolistriknya. Adanya gugus amino dan karboksil bebas pada ujung-ujung rantai molekul protein, menyebabkan protein mempunyai banyak muatan (polielektrolit) dan bersifat amfoter (dapat bereaksi dengan asam maupun basa). Daya reaksi berbagai jenis protein terhadap asam dan basa tidak sama, tergantung dari jumlah dan letak gugus amino dan karboksil dalam molekul. Dalam larutan asam (pH rendah), gugus amino bereaksi dengan H⁺, sehingga protein bermuatan positif. Sebaliknya, dalam larutan basa (pH tinggi) molekul protein akan bereaksi sebagai asam atau bermuatan negatif. Pada pH isolistrik muatan gugus amino dan karboksil bebas akan saling menetralkan sehingga molekul bermuatan nol (Winarno, 1997). Berikut reaksi dari keamfoteran protein: 

Gambar 8 Reaksi Keamfoteran Protein dalam Suasana Asam

Gambar 9 Reaksi Keamfoteran Protein dalam Suasana Basa

Pengendapan oleh Alkohol. Prinsip uji pengendapan oleh alkohol ialah pengendapan protein, protein dapat diendapkan dengan penambahan alkohol. Pelarut organik akan mengurangi konstanta dielektrika dari air, sehingga kelarutan protein berkurang, dan juga karena alkohol akan berkompetisi dengan protein terhadap air (Winarno 1997). Berdasarkan hasil perobaan, dihasilkan larutan albumin + buffer asetat pH 4.7 + etanol menghasilkan larutan yang sangat keruh dibandingkan larutan yang lain. Hal ini karena buffer asetat memiliki pH 4.7 yang sama dengan pH isolistrik albumin (4.55-4.90) atau dapat dikatakan telah terjadi peristiwa isoelektrik (Winarno 1997). Berikut reaksi pengendapan protein oleh alkohol dengan campuran buffer pH 4.7:

Gambar 10 Reaksi Pengendapan Protein oleh Alkohol dengan Buffer pH 4.7

Denaturasi Protein. Prinsip dari denturasi ialah sebuah proses di mana protein atau asam nukleat kehilangan struktur tersier dan struktur sekunder dengan penerapan beberapa tekanan eksternal atau senyawa, seperti asam kuat atau basa, garam anorganik terkonsentrasi, misalnya pelarut organik seperti alkohol atau kloroform, atau panas (Winarno 1997). Penambahan buffer asetat pH 4.7 pada tabung satu dan dua bertujuan agar pH isolistrik tercapai, sehingga albumin dapat terdenaturasi. Penambahan HCl, NaOH, dan pemanasan pada albumin bertujuan agar struktur protein rusak atau kehilangan struktur tersier maupun sekundernya sehingga protein mengalami perubahan bentuk maupun lipatan molekulnya (denaturasi). Berikut contoh reaksi denaturasi protein akibat logam merkuri:

Gambar 11 Reaksi Denaturasi Protein Akibat Logam Merkuri

Simpulan

            Protein dapat mengendap atau terdenaturasi oleh logam berat, senyawa garam, asam dan basa kuat (HCl dan NaOH), maupun pemanasan. Denaturasi terjadi karena protein mengalami perubahan struktur, baik bentuk maupun lipatan molekulnya. Protein yang mengalami denaturasi kelarutannya berkurang, sehingga akan mengendap pada titik isoelektriknya, seperti hasil pada berbagai percobaan yang telah dilakukan.

Daftar Pustaka

Martoharsono, S. 1998. Biokimia. Jilid 1. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press.

Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia.

Suwarti. 2003. Ekuilibrium Unfolding Protein β-sheet, Streptavidin. Skripsi Sarjana. Fakultas Teknologi Pertanian, IPB. Bogor.

Winarno F.G. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia.

Yandri AS. 2011. Pengaruh Modifikasi Kimia Terhadap Titik Isoelektrik (pl) Enzim Hasil Modifikasi. Jurnal Sains MIPA 17(3):92-98 ISSN 1978-1873. Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Lampung. Bandar Lampung.