Laporan Biokimia
ISOLASI DNA KROMOSOM
Pendahuluan
Ada dua macam asam
nukleat, yaitu asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA). Asam
nukleat merupakan polimer yang bersifat heteropolimer (terdiri atas
monomer-monomer yang berbeda) linier, terutama tersusun atas empat nukleotida. DNA merupakan tempat penyimpanan informasi genetik. DNA merupakan molekul yang sangat panjang,
terdiri dari ribuan deoksiribonukleotida yang bergabung dalam suatu urutan yang
bersifat khas bagi tiap organis. DNA bertanggung jawab atas pewarisan informasi genetik dari suatu generasi
ke generasi berikutnya. DNA juga merupakan bahan organik yang memiliki BM
(berat molekul) paling besar dalam sel, yaitu dalam ukuran juta. Monomer DNA
adalah nukleotida. Satu gen diatur oleh satu molekul DNA, dan satu molekul DNA
diatur oleh ribuan sampai puluhan ribu nukleotida (Lehninger 1982).
Satu komponen pembangun (building
block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang
basa yang disebut nukleotida. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam,
yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin
(G) yang memiliki struktur cincin ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas
sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin tunggal (Faatih 2009). RNA
merupakan rantai polinukleotida berutas tunggal dan pendek. RNA tersusun atas
gugus fosfat, ribosa, dan basa nitrogen. Basa nitrogennya terdiri atas golongan
purin, yaitu adenin dan guanin serta golongan pirimidin, yaitu
sitosin dan urasil (Poedjiadi 1994).
Prinsip yang digunakan
dalam melakukan isolasi DNA ialah sentrifugasi dan spektrofotometri. Prinsip sentrifugasi
ialah memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar
sedangkan substansi yang ringan akan berada di atas (Underwood 1998). Bentuk
yang sangat sederhana dari sentrifus terdiri atas sebuah rotor dengan
lubang-lubang untuk meletakkan wadah/tabung yang berisi cairan dan sebuah motor
atau alat lain yang dapat memutar rotor pada kecepatan yang dikehendaki. Semua
bagian lain yang terdapat pada sentrifus modern saat ini hanyalah perlengkapan
yang dimaksudkan untuk melakukan berbagai fungsi yang berguna dan
mempertahankan kondisi lingkungan saat rotor tersebut bekerja (Hendra 1989).
Spektrofotometri merupakan metode
analisis yang didasarkan pada besarnya nilai absorbsi suatu zat terhadap
radiasi sinar elektromagnetik. Prinsip kerja spektrofotometri adalah dengan
menggunakan spektrofotometer yang pada umumnya terdiri dari unsur-unsur seperti
sumber cahaya, monokromator, sel, fotosel, dan detektor. Sumber radiasi
spektrofotometer dapat digunakan lampu deuterium untuk radiasi di daerah sinar
ultraviolet sampai 350 nm, atau lampu filamen untuk sinar tampak sampai
inframerah. Sinar yang dikeluarkan sumber radiasi merupakan sinar polikromatis,
sehingga harus dibuat menjadi sinar monokromatis oleh monokromator. Radiasi
yang melewati monokromator diteruskan ke zat yang akan diukur dan sebagian
radiasinya akan diserap oleh zat tersebut. Zat yang akan diukur
nilai absorbannya diletakkan pada sel dengan wadah kuvet. Sinar yang
diteruskan akan mencapai fotosel dan energi sinar diubah menjadi energi listrik
(Khopkar 2003).
Alat
dan Bahan
Alat yang digunakan adalah mortar dan pestle, pisau, pipet mohr, gelas piala, neraca
analitik, penangas air, sudip, batang pengaduk, pipet mikro, tabung reaksi,
sentrifuse, mikrosentrifuse, tabung sentrifuse, tabung eppendorf, vortex, dan
spektrofotometri.
Bahan yang digunakan adalah bawang, larutan lisis,
garam, TE buffer atau dH2O steril, NaCl, EtOH dingin, es batu, dan
SDS 10%.
Prosedur
Bawang dihaluskan dengan menggunakan mortar
dan pestle, kemudian ditimbang sebanyak 25 gram. Selanjutnya, ditambahkan
larutan lisis sebanyak 40 ml dan garam sebanyak 1.5 gram garam. Bawang
dimasukkan dalam gelas piala 250 ml, kemudian ditambahkan 5 ml SDS 10% dan
diinkubasi pada suhu 600 selama 120 menit dalam penangas air dan
sesekali diaduk. Selanjutnya, disentrifuse dan ditambahkan NaCl sebanyak 1
gram, kemudian diaduk dan dibiarkan selama 15 menit dan diaduk sesekali serta dibiarkan
selama 5 menit sampai terbentuk dua lapisan. Setelah terbentuk dua lapisan,
lapisan atas (agak bening) diambil dengan pipet mikro dan dipindahkan dalam dua
buah tabung reaksi. Setelah itu, ditambahkan 20 ml EtOH dingin melalui sisi
tabung, kemudian dibiarkan di dalam es selama dua sampai lima menit. DNA
kromosom akan mengendap pada bagian atas EtOH dan tampak sebagai benang-benang
putih. Selanjutnya, DNA kromosom diambil dengan pipet tetes dan ditempatkan
pada dua tabung eppendorf 1.5 ml, kemudian kedua tabung disentrifuse selama
satu menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Setelah itu, dibuang EtOH pada lapisan
atas tanpa merusak pelet, kemudian ditambahkan 1 ml EtOH ke pelet DNA kromosom.
Selanjutnya, resuspen pelet DNA kromosom dengan vortex dalam 1 ml EtOH dan
disentrifuse kembali selama satu menit, kemudian dituang EtOH dan dibiarkan DNA
kromosom kering dalam bench selama 10 menit. Setelah kering, ditambahkan 1 ml
TE buffer atau dH2O steril. Tahap akhir, diukur absorbansi larutan
DNA dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Hasil
Pengamatan
Hasil pengujian isolasi
DNA kromosom pada bawang sebagai berikut:
Tabel 1 Data Hasil Pengukuran
Konsentrasi DNA dari Umbi Bawang
|
Larutan
|
A260
|
A280
|
A Terkoreksi
|
[DNA] (µg/mL)
|
Rasio A260:A280
|
|
|
A260
|
A280
|
|||||
|
Blanko (TE)
|
0.2843
|
0.2095
|
0.0793
|
0.0930
|
101.1075
|
0.8520
|
|
Sampel
|
0.3636
|
0.3025
|
||||
Pembahasan
Prinsip dasar isolasi
total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan
tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel
jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipuri-fikasi sehingga dihasilkan
pelet sel yang mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid
hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan. Isolasi DNA memiliki
beberapa tahapan, yaitu isolasi sel, lisis dinding dan membran sel, ekstraksi
dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu
mengisolasi sel yang ingin digunakan, yaitu sel umbi bawang. Tahap selanjutnya
yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel. Setelah
dilakukan inkubasi, sitoplasma sel yang telah bercampur dengan pelisis sel
tersebut lalu disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 13000 rpm.
Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan dilakukan ekstraksi di dalam
larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel. Tahap
berikutnya ialah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan nukleus sel
dari zat-zat lainnya. Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk
mengendapkan protein, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling), yang menyebabkan DNA menjadi
terlihat (Faatih 2009).
Percobaan isolasi DNA kromosom yang
digunakan sebagai sampel yang akan diisolasi ialah umbi bawang, karena memiliki
sedikit pati sehingga DNA akan terlihat lebih jelas dan mudah diisolasi.
Pereaksi-pereaksi atau pelarut yang digunakan dalam percobaan ialah larutan buffer TE atau dH2O (0.35 M sorbitol, Tris-Cl pH 7.5, 5 mM EDTA, dan dH2O) untuk
melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak, garam (NaCl) untuk melarutkan DNA, SDS 10% berfungsi untuk memecahkan dinding sel dengan mengemulsi lipid dan
protein merusak interaksi polar pada membran sel, dan larutan lisis (0.2M Tris-HCl pH 7.5, 0005M EDTA pH 8, 2M NaCl, dan 2% CTAB) yang berfungsi melisis dinding sel atau sebagai reagen pelisis supaya
komponen DNA dalam sitoplasma sel bisa keluar dan diisolasi (Faatih 2009). Etanol dingin berfungsi dalam pengikatan strand DNA yang telah terkumpul
kerena pemekatan oleh garam. Hal ini karena
kerapatan alkohol lebih kecil dibandingkan kerapatan air maka alkohol akan
berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi. Strand-strand DNA yang
terikat oleh alkohol akan nampak sebagi benang-benang putih yang terapung di
atas filtrate (Brush 1994).
Pengukuran konsentrasi DNA dari umbi
bawang menggunakan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Alasannya agar nilai
perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm dapat digunakan
sebagai indikator kemurnian
DNA. DNA dinyatakan murni apabila memiliki nilai
perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm (A260 : A280)
berkisar 1.8-2 (Faatih 2009). Berdasarkan hasil pengamatan dan pengukuran
konsentrasi DNA dari umbi bawang, diperoleh rasio atau nilai
perbandingan serapan A260 : A280 kurang dari 1.8 yaitu sebesar 0.852. Hal ini
menunjukkan dalam percobaan isolasi DNA umbi bawang belum menghasilkan isolasi
DNA yang murni. Hal ini dikarenakan masih besarnya kontaminasi RNA dalam sampel
(Faatih
2009).
Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan DNA kromosom dari komponen lain seperti protein ataupun
RNA. Sehingga DNA kromosom yang memiliki bobot molekul lebih besar akan berada dibagian dasar setelah disentrifugasi sedangkan substansi lain yang
ringan akan berada di atas. Tahap pada percobaan isolasi DNA kromosom salah
satunya dilakukan inkubasi pada suhu 60oC, alasannya untuk mendapat
ekstrak sel dan mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh suhu. Apabila
kristal protease diganti dengan NaCl maka hasil yang didapat akan tetap sama.
NaCl dapat menyebabkan DNA menjadi larut karena ion Na+ mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub
negatif fosfat DNA yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling
tolak menolak satu sama lain sehingga pada saat ion Na+ membentuk
ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA. Hal ini akan menyebabkan DNA akan terkumpul (Brush 1994).
Simpulan
Berdasarkan hasil pengamatan dan pengukuran
konsentrasi DNA dari umbi bawang, diperoleh rasio atau nilai
perbandingan serapan A260 : A280 kurang dari 1.8 yaitu sebesar 0.852 yang menunjukkan
DNA yang dihasilkan belum murni. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu
isolasi sel, lisis dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan,
purifikasi, dan presipitasi. DNA kromosom memiliki bobot molekul yang besar
dibandingkan molekul dalam sel lainnya yang dibuktikan dalam prinsip
sentrifugasi.
Daftar Pustaka
Brush A.
1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2.
Jakarta: Gramedia.
Faatih M.
2009. Iolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal
Penelitian Sains & Teknologi 10(1):61–67. Jurusan Pendidikan Biologi
FKIP, Universitas Muhammadiyah Surakarta. Surakarta.
Hendra
A. 1989. Teknik pemisahan Dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press.
Khopkar SM. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik.
Jakarta: UI Press.
Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar
Biokimia Jilid 3. Maggy Thenawijaya, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan
dari: Principles of Biochemistry.
Poedjiadi A. 1994. Dasar-Dasar
Biokimia. Jakarta: Penerbit UI-Press.
Underwood AL. 1998. Kimia Analisa Kuantitatif. Hilarius Wibi H, penerjemah. Jakarta: Erlangga.
Terjemahan dari: Quantitative Analysis.
Lampiran
|
·
A
terkoreksi (A260) = Asampel – Ablanko
= 0.3636 – 0.2843 = 0.0793
·
A
terkoreksi (A280) = A sampel – Ablanko
= 0.3025 – 0.2095 = 0.0930
·
[DNA]
= A260 terkoreksi x 50
µg/mL x Fp
= 0.0793 x 50 µg/mL x 25.5
= 101.1075
µg/mL
·
Rasio
A260 : A280 = A260
Terkoreksi : A280 Terkoreksi
=
0.0793 : 0.0930 = 0.8520
Comments
Post a Comment