Laporan Mikrobiologi

IDENTIFIKASI BAKTERI

(Karakterisasi Sifat Biokimia dan Fisiologis Bakteri)

Pendahuluan

Mikroorganisme terdiri dari beberapa kelas. Bakteri dan yeast adalah contoh mikroorganisme. Mikroorganisme dalam hidupnya melakukan aktivitas metabolisme. Metabolisme mikroorganisme merupakan proses-proses kimia yang terjadi di dalam tubuh mikroorganisme. Metabolisme disebut juga reaksi enzimatis, karena metabolisme terjadi selalu menggunakan katalisator enzim. Dalam metabolisme mikroorganisme, energi fisik atau kimiawi dikonversi menjadi energi melalui metabolisme mikrorganisme dan disimpan dalam bentuk senyawa kimia yang disebut adenosine 5′ -triphospate (ATP) (Syamsudin dkk 2008).

Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa senyawa organik kompleks dapat dihidrolisis oleh enzim menjadi senyawa-senyawa organik sederhana sehingga lebih mudah dimetabolisme sel mikroorganisme. Enzim merupakan molekul biopolimer protein yang tersusun dari serangkaian asam amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim berfungsi sebagai aktivator dalam reaksi biokimia dan bersifat spesifik terhadap substrat sehingga mmpermudah proses pemutusan suatu rantai kompleks tertentu. Setiap enzim memiliki daerah sisi ikatan yang dinamakn sisi aktif. Dalam sisi aktif ini terdapat sisi ikatan yang memungkinkan substrat memepunyai orientasi tetap membentuk iaktan komplek enzim-substrat, dan sisi katalitik yang memungkinkan terjadinya reaksi yang dikatalisis. Reaksi yang dikatalisis enzim dipengaruhi oleh bebrapa faktor, yaitu suhu, pH, konsentrasi substrat, produk, serta keberadaan aktivator dan inhibitor (Syamsudin dkk 2008).

Karakterisasi morfologi bertujuan untuk mengamati baik morfologi koloni maupun morfologi sel bakteri pada isolat bakteri yang telah lolos seleksi. Ketika ditumbuhkan dalam media yang bervariasi, mikroorganisme akan menunjukkan penampakan makroskopis yang berbeda-beda pada pertumbuhannya. Perbedaan ini disebut dengan karakterisktik kultur, yang digunakan sebagai dasar untuk memisahkan mikroorganisme dalam kelompok taksonomik (Budiyanto 2008).

Setiap jenis spesies bakteri mempunyai karakterisasi sifat biokimia dan fisiologi yang khas. Sifat-sifat ini dapat dijadikan acuan dalam proses identifikasi. Oleh karena itu dalam praktikum kali ini dilakukan uji enzimatik untuk mengetahui karakteristik sifat dari bakteri. Pengujian secara fisiologis juga dapat dilakukan untuk mengelompokkan taksonomi mikroorganisme termasuk taksonomi bakteri. Pengujian fisiologis terdiri dari uji motilitas, uji katalase, uji oksidase, uji gelatin, dan uji fermentatif/oksidatif.  Selain kelima uji tersebut, dapat juga dilakukan uji yang lain, yaitu dengan menggunakan uji hidrolisis pati, uji indol, uji methyl red, uji sitrat, dan uji hidrolisis urea (Hadioetomo 1993).

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan ialah pembakar spirtus, korek api, lap atau tissue, inkubator, spidol, label, ice-bath, gelas objek, tabung tertutup, rak tabung, pipet tetes, dan jarum ose.

Bahan yang digunakan ialah alkohol 70%, kertas cakram, reagen P-aminodimetyl aniline oxalate 1%, koloni bakteri E.colli, media O/F, paraffin, media SIM (Sulfida Indol Motility), dan nutrien gelatin.

Prosedur

Uji oksidase. Pertama, meja dan tangan dibersihkan dengan alkohol 70%, kemudian dinyalakan pembakar spirtus. Selanjutnya, disiapkan dua buah gelas objek yang bersih dan steril, kemudian diletakkan kertas ckram pada masing-masing gelas objek. Salah satu kertas cakram dijadikan sebagai kontrol. Selanjutnya, masing-masing kertas cakram ditetesi dengan reagen P-aminodimetyl aniline oxalate 1%, kemudian diteteskan koloni bakteri ke salah satu kertas cakram yang tidak dijadikan sebagai kontrol dengan menggunakan pipet tetes secara aseptis. Lihat perubahan warna yang terjadi. Jika warna berubah menjadi merah marun maka hasil uji positif, sedangkan bila tidak terjadi perubahan maka hasil uji negatif. Hasil uji positif tertunda jika warna merah marun muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi sampel.

Uji oxidatif / fermentatif. Pertama, meja dan tangan dibersihkan dengan alkohol 70%, kemudian dinyalakan pembakar spirtus. Selanjutnya, disiapkan dua tabung yang telah berisi media O/F, kemudian diambil koloni bakteri dengan jarum ose dan diinokulasikan vertikal pada kedua tabung yang berisi media O/F secara aseptis. Salah satu tabung ditambahkan paraffin cair 1 ml, kemudian kedua tabung di inkubasi selama 24 jam. Hasil pengujian menandakan reaksi oksidatif bila tabung yang tidak diberi paraffin berubah menjadi kuning, sedangkan menandakan reaksi fermentatif bila tabung yang diberi paraffin berubah mejadi kuning atau kedua tabung berubah warna menjadi kuning.

Uji motilitas. Pertama, meja dan tangan dibersihkan dengan alkohol 70%, kemudian dinyalakan pembakar spirtus. Selanjutnya, disiapkan tabung yang telah berisi media SIM (Sulfida Indol Motility), kemudian diambil koloni bakteri dengan jarum ose dan diinokulasikan vertikal pada tabung yang berisi media SIM (Sulfida Indol Motility) secara aseptis. Setelah itu, di inkubasi selama 24 jam. Hasil uji motilitas bakteri diperlihatkan dengan adanya pertumbuhan pada permukaan medium dan tidak hanya pada bekas tusukan.

Uji gelatin. Pertama, meja dan tangan dibersihkan dengan alkohol 70%, kemudian dinyalakan pembakar spirtus. Selanjutnya, disiapkan tabung yang telah berisi nutrien gelatin, kemudian diambil koloni bakteri dengan jarum ose dan diinokulasikan vertikal pada tabung yang berisi nutrien gelatin secara aseptis. Setelah itu, di inkubasi pada suhu 37^oC selama 2 malam satu hari, kemudian dimasukkan dalam ice-bath. Hasil uji gelatin yang tidak mengalami hidrolisa akan memebeku, sedangkan yang terhidrolisa akan tetap cair atau menunjukkan reaksi positif.

Hasil Pengamatan

Berdasarkan percobaan identifikasi karakterisasi sifat biokimia dan fisiologis bakteri dengan beberapa macam uji, didapatkan hasil sebagai berikut:

Gambar 1 Hasil Uji Oksidase Bakteri E.Colli (tidak ada perubahan warna (-))

Gambar 2 Hasil Uji O/F Bakteri E.Colli (a) Paraffin: berubah warna menjadi kuning (+) (b) Non Paraffin: berubah warna menjadi kuning (+)

Gambar 3 Hasil Uji Motilitas Bakteri E.Colli (tidak adanya pertumbuhan pada permukaan medium dan pada bekas tusukan (-))

Gambar 4 Hasil Uji Gelatin Bakteri E.Colli (masih cair pada suhu dingin (+))

Pembahasan

Uji oksidase. Awal oksidase suatu substrat oleh jasad renik, hidrogen dipindahkan dari substrat tersebut oleh enzim khusus yaitu dehidrogenase. Melalui kerja enzim pernafasan, kemudian atom hidrogen tersebut dibawa ke penerima terakhir. Sebagai penerima atom H dan electron terakhir adalah zat warna atau indicator oksidasi-reduksi. Zat warna akan tereduksi dan berubah warna. Berdasarkan hasil percobaan, diperoleh tidak terjadi perubahan warna pada kertas cakram yang menandakan negatif mengandung enzim oksidase.

Uji oxidatif / fermentatif. Media O/F merupakan salah satu media yag digunakan untuk pengujian fisio-metabolisme suatu bakteri yaitu untuk mengetahui kemampuan memecah karbohidrat (glukosa) dalam suasana aerobik (oksidatif) dan anaerobik (fermentatif). Hasil percobaan dengan menggunakan bakteri gram negatif, diperoleh kedua tabung berubah warna menjadi kuning yang berarti menandakan terjadi reaksi fermentatif. Hal ini tidak dapat dipastikan jenis bakterinya, dikarenakan dalam tabel pengelompokkan bakteri gram negatif (Cowan) tidak terdapat uji O/F yang menghasilkan hasil fermentatif (F) dan shape dalam bentuk coccus (S). Akan tetapi, dapat dipastikan koloni bakteri yang digunakan ialah E.colli, karena dalam percobaan sudah diketahui jenis koloni bakteri yang digunakan dan dalam hal ini penggunaan analisa dengan tabel Cowan hanya untuk memastikan bakteri yang digunakan.

Uji motilitas. Media SIM (Sulfida Indo Motility) merupakan salah satu media yang digunakan untuk pengujian fisio-metabolisme suatu bakteri yaitu untuk mengetahui kemampuan membentuk indol (produk hasil degradasi protein), ikatan sulfide dan motilitas atau pergerakan bakteri. Hasil percobaan, diperoleh tidak adanya pertumbuhan pada permukaan medium dan pada bekas tusukan yang menandakan negatif terjadi pergerakan bakteri. Berdasarkan literatur, seharusnya E.colli termasuk bakteri motil, E.colli memiliki flagel yang bersifat lateral yaitu peritrik dimana flagel tersebar dari ujung-ujung sampai pada sisi. Rata-rata pergerakan bakteri E.coli kira-kira 25 u per detik atau 10 cm per jam (Melliawati 2009). Bakteri motil ialah bakteri yang bergerak dengan menggunakan flagel atau silia. Sel yang bergerak dengan dorongan flagella akan bergerak lebih aktif. Jika suatu sel tersebut motil, akan menciptakan jalur gerak yang tak beraturan. Flagella merupakan struktur komplek yang tersusun atas bermacam-macam protein termasuk flagelin yang membuat flagella berbentuk seperti tabung cambut dan protein kompleks yang memanjang dinding sel dan membran sel untuk membentuk seperti cambuk, flagella digunakan bakteri sebagai alat gerak (Pramono 2007).

Uji gelatin. Prinsip dari uji ini ialah biakan diinokulasi pada media dengan cara menusukkan mikroba yangakan diujikan sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan, kemudian diinkubasipada suhu 35^oC selama 24 jam. Jika media gelatin mencair, maka langkah selanjutnya dimasukkan dalam lemari es selama 30 menit. Pencairan gelatin diamati, jika terdapat gelatin yang mencair menunjukkan uji positif. Namun jika tidak mencair maka di inkubasi kembali selama 1 minggu pada suhu 35^oC. Uji negatif jika setelah 1 minggu gelatin tidak mencair sedikitpun (Lay 1994). Gelatin adalah protein yang diperoleh dari hidrolisa kalogen yitu zat pada jaringan penghubung dan tendon dari hewan. Gelatin akan terurai oleh jasad renik yang mempunyai enzim proteolitik. Larutan gelatin bersifat cair pada suhu ruang atau suhu kamar dan padat apabila berada dalam lemari es. Bila gelatin telah dihidrolisa oleh jasad renik akan tetap bersifat cair meskipun berada dalam lemari es (Hadioetomo 1993). Berdasarkan hasil percobaan, diperoleh nutrien gelatin masih mencair pada suhu dingin yang menandakan positif terhidrolisa.

Simpulan

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, diperoleh pada uji oksidase tidak terjadi perubahan warna pada kertas cakram yang menandakan negatif mengandung enzim oksidase. Uji O/F diperoleh kedua tabung berubah warna menjadi kuning yang berarti menandakan terjadi reaksi fermentatif dan jenis bakterinya ialah E.colli. Uji motilitas diperoleh tidak adanya pertumbuhan pada permukaan medium dan pada bekas tusukan yang menandakan negatif terjadi pergerakan bakteri. Uji gelatin diperoleh nutrien gelatin masih mencair pada suhu dingin yang menandakan positif terhidrolisa.

Daftar Pustaka

Budiyanto M. 2008. Klasifikasi Mikroorganisme. Malang: umm press.

Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. Jakarta: PT Gramedia Pustaka.

Lay BM. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raja Grafindo Persada.

Melliawati R. 2009. Escherichia Coli dalam Kehidupan Manusia. Jurnal Biotek 4(1):10-14. Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI. Bogor.

Pramono H. 2007. Penggolongan Mikroba. Bandung: Kurnia.

Syamsudin, S. Purwati, dan A. Taufick. 2008. Efektivitas Aplikasi Enzim dalam Sistem Lumpur Aktif pada Pengolahan Air Limbah Pulp dan Kertas. Jurnal Berita Selulosa 43(2):83-92 ISSN 0005 9145. Balai Besar Pulp dan Kertas. Bandung.